摘要：菌落总数作为判定化妆品被污染的程度标志，关系到产品的卫生质量及使用的安全性，本文针对膏状浴盐菌落总数的测定进行详述，并对今后化妆品菌落总数的检测方法及方向进行探讨和展望。
关键词：膏状浴盐 菌落总数 测定 方法探讨
微生物的世界变化莫测、令人着迷，它无处不在，存在于我们生活的每一个角落，存在于产品生产的每一道工序中。由于膏状浴盐在生产过程中是先制成胶体、加盐后再制成膏体的，胶体系统有时会受到微生物的污染和降解，膏体系统偶尔也会有耐盐菌存活，污染源包括原材料、制作过程、设备和操作人员等；产品包装的设计在膏状浴盐微生物污染中举足轻重，其中广口容器最易受到污染；膏状浴盐的水分较粉状浴盐多，更易支持微生物的生长……由于浴盐成品本身是不再灭菌的，并且其生产原料通常也是不灭菌的，只是在生产中通过溶解原料时加温和半成品存放中照射紫外线来杀菌，因此，我们不可能100%地清除浴盐生产原料、设备、环境和操作过程中的微生物。只能通过质控和检测来减少微生物进入到产品中，将其控制在一个对生产和对消费者相对安全的水平。
一、检测目的
微生物是影响化妆品卫生安全的重要指标，也是产品卫生质量合格与否的重要标志。根据权威检验部门的结论及多年来化妆品检测的数据分析：化妆品微生物检测指标中合格率较低的项目主要是菌落总数，其次为霉菌和粪大肠菌群，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌只是在个别化妆品中才会检出。绝大多数化妆品微生物不合格的原因是菌落总数超标，而较少或根本检测不出肠道细菌、真菌或致病菌。由此可见，影响化妆品质量的主要微生物指标是菌落总数，但同时它与其它菌之间存在着一定的关联。化妆品中菌落总数越多，粪大肠菌群、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检出率也越高；反之，如果在某一样品中检出金黄色葡萄球菌、粪大肠菌群和铜绿假单胞菌，那么该样品的菌落总数肯定会超过国标的相关规定。
随着人们对化妆品要求的不断提高，化妆品厂家在生产中增添了多种动植物原料和营养成份，为细菌的生长繁殖创造了良好的条件。虽然沐浴盐的主要成分是盐，盐具有杀菌消炎的功效，但在膏状浴盐配方设计过程中考虑到盐颗粒在胶体中悬浮的均匀性以及使用时泡沫是否丰富等因素会将盐含量限制在一个合适的范围中。只是沐浴盐与其它沐浴液相比，微生物生长的机会非常小甚至没有，但不能保证产品一定是无菌的，需要通过成品微生物检测来判定。为及时掌握膏状浴盐在生产过程中的卫生质量与卫生安全，了解和核查生产中所选用原料、生产设备、工艺流程及操作人员的卫生状况，判定产品在生产过程中被微生物——细菌污染的程度，我们建议采用标准平板计数法与TTC琼脂培养基法相结合来进行菌落总数的测定，以此作为改进生产工艺及判定成品卫生质量是否合格的依据。
二、菌落总数的定义及检测原理
菌落的英文是（colony），定义为细菌和其它几种微生物在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。各种细菌的菌落各自具有一定的特征，按其特征的不同可以在某种程度上鉴别某种细菌，为微生物检验提供依据。菌落总数系指检样经过外包装清洁消毒，样品称量、稀释等处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH 值、需氧性质等），分裂生长成一个个肉眼或低倍显微镜下可见的细菌集落，并通过平皿计数，1g（或1ml）检样中所含菌落的总数。其培养的原理是指检样在被稀释到一定浓度后，吸取一定量的检样，检样中的细菌细胞和培养基均匀混合后，每个细菌细胞都形成一个肉眼可见的菌落的假设为基础的。由于各种化妆品中被污染的细菌种类不同，如浴盐中会存在由海水或井下卤水带来的极少量的嗜盐菌、表面活性剂原料中偶尔夹带的枯草芽孢杆菌等，每种细菌都有它一定的生理活性，培养时对培养要求，如温度、时间等有所不同，而在实际检验工作中，不可能满足所有菌的培养条件，因此所测定的结果只包括在本方法规定的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48小时）生长的一群嗜中温的需氧性菌落总数。厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，在该条件下难以繁殖生长。即实际存在的菌落数大于检测出来的菌落总数。菌落总数并不能区分其中细菌的种类，有时也被称为杂菌数、需氧菌数等。
三、检测方法
菌落总数的测定是将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1ml置于灭菌平皿中与TTC—卵磷脂吐温80营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，并依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含有的细菌菌落总数。检验方法参见2007年版《化妆品卫生规范》。由于规范中的检测方法是针对所有化妆品的，故本文在规范方法的基础上，结合膏状浴盐的产品特性及检测的实践经验，对其菌落总数的测定进行了补充和注解，以供盐行业内浴盐微生物检测人员交流参考。
基本操作一般包括：样品采集和制备－－稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
（一）仪器和试剂
1.仪器
250ml三角瓶、200ml量筒、15×150mm试管、直径 9cm灭菌平皿、10ml、2ml和1ml灭菌刻度吸管、酒精灯、放大镜、pH 计或精密 pH 试纸、高压灭菌器、36℃±1℃恒温培养箱。
2.试剂
（1）灭菌蒸馏水
成分： 蒸馏水 1000mL
制法：将蒸馏水分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶 90ml，103kPa（121℃ 15 lb）下高压灭菌20min。
（2）卵磷脂吐温80—营养琼脂培养基
成分：蛋白胨 20.0g
牛肉浸出粉或膏 3.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
卵磷脂 1.0g
吐温80 7.0g
目前该培养基市上有售，不需要自行配制，购买时应选择技术力量强、通过质管体系认证的企业产品，培养基品牌要相对固定，不要经常更换厂家，以避免试验中因使用不同厂商的产品所造成的误差，影响检验结果的准确性。由于培养基的原材料不同，品牌生产商使用的原料蛋白胨质量较好、颜色偏浅，制出的培养基透明度高，菌落易分辨，个别厂商生产的培养基杂质较多，菌落与杂质较难分辨。建议到杭州华东医药股份有限公司或杭州微生物试剂有限公司等正规渠道购买。
使用方法：取本品51g于1000ml蒸馏水中，加热、搅拌至溶解，经121℃、20min灭菌后，冷却至45—50℃时，倾注平皿备用（具体参照培养基上的使用说明）
0.5％氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）
成分： TTC 0.5g
蒸馏水 100ml
制法：溶解后过滤，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 高压灭菌，装于棕色试剂瓶内，置4℃中冰箱备用。
（二）样品的采集及制备
1.供检样品的采集
（1）所采集的样品，应具有代表性，一般视每批浴盐数量的大小，根据产品标准中的检验规则抽取相应数量的包装单位。由于膏状浴盐呈膏体粘稠形态，灌装前成品取样时不应集中一点，宜多采几个部位。
（2）待检的浴盐，应严格保持原有的包装状态，软管、塑料罐等包装不应有破损，检验前不得打开，防止样品被污染。若包装表面有污染，检验前应用酒精棉花擦拭干净。
（3）接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应存放在室温阴凉、干燥处，不需冷藏或冷冻。
（4）特殊情况下，若只有一个样品而同时需做多种检验，如细菌、重金属、理化等，则应先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
（5）操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。如果是出厂检验，应用75%酒精在包装开口处擦拭后取样。全部操作应在超净工作台或经过灭菌处理的无菌室内进行。
2.供检样品的制备
称取10g样品，加到装有玻璃珠和90ml蒸馏水并已灭菌的锥形瓶中，充分振荡混匀（如有均质器，均质1~2min效果更好），静置15min。取其上清液作为1:10的检液。若样品过于粘稠，可称取25g样品加到装有225ml蒸馏水和玻璃珠并已灭菌的锥形瓶中，以加大样品量来提高检样的代表性。
3.样品的稀释
（1）稀释液：样品稀释液一般是灭菌生理盐水，但对含盐量较高的膏状浴盐进行稀释时，可采用灭菌蒸馏水，以防检样稀释液氯化钠浓度过高抑制了细菌的生长。在每支15×150mm试管中吸入9ml蒸馏水，制作数量根据样品的多少及稀释倍数而定，灭菌待用。
（2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌蒸馏水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液，注意吸管进出三角瓶或试管时，吸管口不触及瓶口、管口的外围部分。另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，制成10倍递增稀释液，以此类推。平行样重复此操作。
（3）为减少样品的稀释误差，在进行连续递增稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
4.倾注培养
（1）根据样品被污染的情况估计，选择2—3个适宜的稀释度，每个稀释度做两个平皿（平行样），吸取1ml选定稀释度的稀释液于灭菌平皿中。由于膏状浴盐含盐量较高，从以往的经验检测数据来看，选择1/10和1/100的稀释度比较合适，但如果在浴盐中添加了较多的天然植物或中草药成分的话，选择1/100和1/1000的稀释度比较适宜。
（2）待检用的培养基应在45-50℃水浴内保温，倾注时培养基温度过高会烫死部分不耐高温的细菌，使菌落总数检测结果偏低；过低琼脂易凝固结块而不能与检液充分混匀，且培养后的平皿不易计数。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
（3）将融化并冷却至45-50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，倾注量在12ml—20ml之间，以每皿约15ml为宜，培养基过厚会影响观察计数，太薄又易于干裂。倾注时，培养基底部若有沉淀物，应将底部弃去，避免过多的杂质与菌落混淆而影响计数观察。
（4）为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并轻轻地水平晃动平皿，使样品与培养基充分混合均匀。检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜太长，一般不超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。
（5）分别将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（灭菌蒸馏水）的灭菌平皿内作稀释液空白对照、倾入不加样品的灭菌空平皿内作培养基空白对照、倾入敞开放置于无菌室操作台上的灭菌空平皿作空气空白对照。培养基空白对照可以避免培基中的杂质与细菌菌落发生混淆、不易分辨的情况，以便计数时作对照观察。空气（环境）空白对照可以每年检验2—3次，采用操作台面上对角线五点检测，而稀释液和培养基空白对照最好每次都做。
（6）待琼脂凝固后，翻转平皿，置 36℃±1℃培养箱内培养 48h±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
（7）培养时间规范上要求48h±2h，根据多次观察，由于膏状浴盐含有一定量的盐分，检出的菌落总数较少，一般1/10只有个位数，1/100几乎没有。在生产销售紧急的情况下，通过24h的培养也可以计数，只是培养48h后，菌落个头变得更大更明显而已，此时计数不易发生差错，但在正常情况下应按规范上要求的时间培养。
（8）为便于区别浴盐中的颗粒与菌落，可在每100ml卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1ml0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而浴盐的颗粒颜色则无变化。
（9）培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。
5.计数报告
培养到时间后，点数菌落数。先用肉眼观察，必要时用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数，计算出原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。
（1）到达规定的培养时间后，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃环境中，但不得超过24h。
（2）计数时应选取菌落数在30～300之间的平皿，作为菌落总数计数的依据。 若有二个稀释度均在30～300之间时，则按规范要求以二者之比值决定，若比值小于或等于2则取平均数，比值大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数报告之。
（3）若所有稀释度的平均菌落数均不在计数区间，如均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；如均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300个，而有的又小于30个，均不在30～300个之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有的稀释度均无菌落生长，则应按每g或每ml小于10CFU报告之。
（4）不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（膏状浴盐有时会出现逆反现象），不应作为检样计数报告的依据。若空白对照平板出现菌落，则此次检测结果无效。
（5）当平皿上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在几条不同来源的链，则每条链应按一个菌落计算，不应把链上生长的每一个菌落分开计数。如有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。
（6）当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布又很均匀，则可取平板的一半或1/4计数，再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。
（7）菌落计数的报告，菌落数在 10 以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
（8）菌落的形成单位CFU，CFU是cotong forming units的英文缩写，意思是菌落形成单位数，鉴于化妆品检样的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状、成片花点样或成堆的形式存在，因而在营养琼脂出现的菌落可以来源一个细胞群，也可以是一个单个细胞，因此平板计数不报告准确的活菌个数，而是以单位重量、体积或表面积内形成单位数(CFU)报告，CFU／g(m1)表示每克或每毫升样品中含有多少个菌落形成单位。
四、检验方法探讨
目前我国对化妆品规定一律按《化妆品卫生规范》（2007年版）进行检验，它较以前的《化妆品卫生规范》（2002年版）和《GB 7918.2化妆品微生物标准检验方法》（1987年版）有明显的改进。它的实施，对于进一步规范化妆品原料、生产、检验和包装具有非常重要的指导意义，但是由于《化妆品卫生规范》适用于所有的化妆品，其中有一些细节问题还需要补充和完善，探讨如下：
（一）菌落总数空白对照的改进
《化妆品卫生规范》中5.2要求的空白对照主要为培养基空白对照，该空白对照上如果没有菌落生长,说明检测过程所用的培养基、培养皿等用具的灭菌情况和检验的操作过程符合无菌要求；但如果有2个以上菌落生长，则需追加空白对照平皿进行培养观察，以鉴别和判定到底是培养基还是培养皿、吸管等器具可能存在的污染，如有可能则在消除污染之后重新检测。为减少误差，建议在检测过程中：1）将培养基空白对照由1个增至2个，使空白对照的数量与检样每个稀释度测定的平皿数量( 均为2 个平皿)一致,这样可以更好地反映无样品时的细菌数量、反映器具和培养基的灭菌情况以及无菌操作情况；2）每次检测样品时增加稀释液的平行空白对照，从而判断稀释液和试管的的灭菌情况；3）根据无菌室的灭菌情况，每年进行数次环境检测，利于发现环境（空气）和检验环节中存在的问题，进而更加准确地测定样品的菌落总数。
（二）中和检液的pH值
由于化妆品在生产过程中使用的一些原材料呈酸或碱性，所以最终产品可能偏酸或碱性。虽然多数生产厂家在成品前会将产品的pH值调至中性，但也有一些企业在产品中增添了一些功能性特殊原料，而这些原材料的功效必须在酸或碱性的环境中才能显现出来，因此，建议做菌落总数时，先测一下原液或稀释后检液的pH值，若原液很粘稠，无法直接测定pH值，可用1/10检液测定，发现其偏酸或碱时，在原液或稀释后的检液植入平皿前将其调成中性，调中性的酸碱一般使用弱酸或弱碱，如冰醋酸或纯碱的稀释液等，否则在太酸或碱的培养环境下细菌是无法生长的，这样做会利于企业出厂检验的控制。尽管一些酵母和霉菌可耐受酸性环境（pH<4），但一般细菌生长的pH值是在中性范围中，许多化妆品中的细菌都受到其不利pH值的抑制，如pH<4或pH>10。但随着pH值逐渐远离中性，细菌在其中的生长能力也逐渐减弱，在具有极端pH值的酸或碱环境中，很难发现有细菌生长。
（三）减少稀释引起的误差
在检验中，由于化妆品中含有防腐剂、消毒剂及某些修复成分等，抑制了细菌的生长, 会造成不同稀释度检出的菌落总数异常现象，而稀释后，灭菌生理盐水或灭菌蒸馏水等稀释液缓解了防腐剂、消毒剂的作用，细菌的生存环境有了一定的改善, 使细菌开始生长繁殖，出现了样品在第一稀释度无菌生长，而第二或第三稀释度有细菌生长（即稀释度高的菌落数反而比稀释度低的多）的情况。出现这种现象主要是防腐剂等化学物质，抑制了样品中细菌的生长。在稀释度高时，防腐剂的浓度低；稀释度低时，防腐剂浓度高，从而造成菌落总数的逆反现象，针对这种情况：1.可使用抗干扰微生物培养基，其可分为抗防腐剂型、抗消毒剂型和抗臭氧型等。但抗干扰微生物培养基的价格通常比普通培养基贵，且要有针对性地使用，否则会无效，并造成另外的干扰。2.视样品不同，不能一概使用灭菌生理盐水或灭菌蒸馏水作稀释液, 应在稀释液配制中加入适量的能中和防腐剂或抑菌剂的物质，以减少稀释带来的误差。
（四）提高细菌总数的检出率
细菌种类繁多，每种细菌都有它一定的生理特性和培养要求，而在实际检测过程中，我们不可能做到满足所有菌的要求，只包括在一定的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48小时）生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的细菌菌落总数。而实际上在所检样品中可能不止存在这些细菌。当我们在做试验研究或想检出更多的菌种时，我们就要配制一种营养成分更全面、更丰富而又极易被大多数微生物吸收利用的培养基。研究资料显示，使用美国食品药品管理局(FDA)的标准平板培养基(即每1000 ml培养基含胰蛋白胨5g、酵母膏2.5g、葡萄糖1g、琼脂 15g)测定细菌总数，比我们现在国内使用的卵磷脂吐温80营养琼脂（即每1000ml培养基含蛋白胨10g、牛肉膏3g、Nacl5g、琼脂15g）平均检出率高23.9%；另一种方法就是对卵磷脂吐温80营养琼脂培养基进行改进，在原来成分的基础上分别添加0.1%葡萄糖和0.1%酵母膏，原因是该培养基没有提供初始纯碳源。培养基中的碳源、氮源均来自牛肉膏和蛋白胨，而葡萄糖是一种绝大多数细菌最易吸收利用的良好碳源，添加0.1%葡萄糖作为碳源对绝大多数细菌的初始生长是极为有利的。酵母膏营养丰富，除提供大量B族维生素、蛋白质、氨基酸、核酸等碳源、氮源外，还提供矿物质以及谷胱甘肽、酶类、核酸等具有生理活性作用的营养成分，添加0.1%的酵母膏利于绝大多数微生物的生长。
（五）测定方法展望
随着微生物学和检测技术的发展，产生了许多关于菌落总数测定的新技术和新方法，目前化妆品菌落总数测定的标准方法是平板计数法，其优点是能较好地反映菌落的疏密程度，重复性和平行性较好，可获得活菌菌落信息，是经典的计数方法，缺点是培养时间长，需要配制培养基和清洗、消毒培养器皿等大量辅助性工作，操作过程繁琐。相对于食品的直接入口而言，化妆品涂抹、喷洒于人体表面的特性，危害性要略小一些，但在生产任务紧急的情况下，产品需要当天出货，采用规范的检测方法48小时获得的检测结果实际意义有限。由此，快速检测技术应运而生，并由培养水平向分子水平迈进。目前主要应用于食品但也有部分应用在化妆品领域内的快速检测技术有：1.生物电化学方法：常见的有阻抗分析法、伏安分析法、电位电流分析法等；2.ATP生物发光法；3.滤膜法；4.量热法；5.流式细胞术；6.显微图像识别技术；7.固相细胞计数法；8.机器视觉法等。菌落总数是目前国内最常用的微生物检测项目，能否在最短的时间内快捷、准确地反映样品的微生物数量，是我们微生物检测人员今后努力的工作方向，特别是近年来随着分子生物学、微电子技术及生物技术的发展，微生物快速检验技术已有了很大的突破，今后我们的方法标准一定会更加便捷、准确、合理、全面！
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